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In situ Hybridisierung

 

Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) ist eine weitverbreitete Methode, die schon seit mehreren Jahrzehnten für viele Fragestellungen eingesetzt wird. Aufgrund der sehr hohen Spezifität und Sensitivität kann FISH auf subzellulärer Ebene Strukturen analysieren oder sogar einzelne Zellen in großen Zellverbänden eindeutig identifizieren und lokalisieren.
Das Nachweisverfahren beruht darauf, fluoreszenz-markierte Oligonucleotide mit den zelleigenen Nucleinsäuren zu hybridisieren. Die Probe kann sich hierbei gegen DNA oder RNA richten und lässt dabei nicht nur Aussagen über das Vorhandensein eines bestimmten Gens zu, sondern auch das Genprodukt in Form einer RNA - und damit Genaktivität - kann nachgewiesen werden. 

Im Bereich der Analyse von Mikroorganismen werden kurze, fluoreszenz-markierte Oligo-Sonden eingesetzt, die an die zelleigene ribosomale RNA hybridisieren. Die hohe Kopienzahl, in der ribosomale RNA pro Zelle vorliegt, ermöglicht einen äußerst sensitiven Nachweis. Durch die hohe Sensitivität der Fluoreszenz in situ Hybridisierung sind Analysen auch von seltenen und nicht-kultivierbaren Proben möglich, sodass ein weites Feld von Analysen denkbar ist (z.B. marine Mikrobiologie, Analyse mikrobieller Kolonien in Biofilmen oder Biogasanlagen, Mikrobiom-Analysen, etc.).
Neben der subzellulären Auflösung von RNA in Zellen ist auch eine quantitative Messung von RNA in Zellen über die in situ Hybridisierung möglich.
 

Fluorescent Probes

Fluoreszenz-Sonden für FISH Analysen

 

Für Fluoreszenz-markierte Oligonucleotid-Proben können stabile und lichtstarke Farbstoffe aus dem gesamten Spektrum des sichtbaren Lichts eingesetzt werden (siehe Fluoreszenzfarbstoffe). Damit können auch bei autofluoreszierenden Umgebungen oder für Multiplex-Analysen passende Kombinationen gefunden werden.

Je nach Fragestellung stehen unterschiedliche Markierungsgrade zur Verfügung:
 

monoProbes

 

monoProbes stellen den Klassiker unter den FISH Sonden dar. Hierbei werden die Probes mit einem Fluoreszenzfarbstoff am 5´-Ende des Oligonucleotids markiert.


 

dopeProbes

 

Durch zweifache Fluoreszenzmarkierungen der Oligonucleotidsonden kann in FISH Experimenten (DOPE-FISH) eine annähernde Verdopplung der Signalintensitäten und somit höhere Lichtausbeuten pro hybridisierter Probe erreicht werden. Aufgrund der zusätzlichen Sensitivität kann diese Technik  auch bei seltenen Targets angewendet werden kann.
Die dopeProbes werden hierbei am 5´- und 3´-Ende mit identischen Fluoreszenzfarbstoffen markiert. 


 

tetraProbes

 

Eine Weiterentwicklung davon sind tetraProbes, die bis zu vier Farbstoffmoleküle an einem Oligonucleotid tragen und dadurch höchst sensitiv sind. Die Fluoreszenzfarbstoffe werden dabei verteilt über die Oligolänge im Rückgrat angeordnet. In hybridisiertem Zustand verhält sich die Signalintensität nahezu linear zur Anzahl der Farbstoffe pro Oligo, d.h. unter ansonsten identischen Bedingungen leuchten tetraProbes etwa doppelt so hell wie dopeProbes und viermal so hell wie monoProbes.
Neben der hierbei üblichen Anbindung der Fluorophore an die 2´-Gruppe des Zuckers, führt auch die Clickreaktion über die Base 5-Ethynyl-dU zu einer nahezu direkten Modifikation am Oligorückgrat. 


 

multiProbes

 

Die interne Click-Modifikation findet nicht nur bei der Herstellung von tetraProbes Anwendung. Vielmehr eröffnen sie vielfältige Möglichkeiten Oligonucleotide mehrfach mit identischen Biomolekülen zu markieren.  
Bei diesen sogenannten multiProbes sind beispielsweise Oligos mit neun internen Fluoreszenzfarbstoffen denkbar. 


 


Literatur:

1. A Straightforward DOPE (Double Labeling of Oligonucleotide Probes)-FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) Method for Simultaneous Multicolor Detection of Six Microbial Populations. Behnama F, Vilcinskasb A, Wagnera M, Stoeckerb K; Appl. Environ. Microbiol. (2012), vol. 78 no. 15 5138-5142.

HRP

HRP-markierte Oligonucleotide


Eine Sensitivitätssteigerung um mehrere Größenordnungen wird durch die Verwendung von HRP-Probes erreicht. Hier wird statt eines Farbstoffs das Enzym Meerrettich-Peroxidase (HRP = Horseradish peroxidase) an die Oligonucleotid-Sonde gekoppelt. Das etwa 40 kDa schwere Enzym setzt an der Stelle, an der das Oligo in der Zelle an seine Zielsequenz bindet, zugegebene Farbstoffe um und führt dadurch am Bindungsort zu einer Amplifikation des Lichtsignals. Durch Kombination von HRP-Probes und Tyramid Signalamplifikations-Systemen (TSA) können, im Vergleich zu Fluorescein-einfach-markierten Sonden, vielfach höhere Signalintensitäten erzielt werden. Diese Methode wird als "Catalyzed Reporter Deposition - Fluorescent in situ Hybridisation" (CARD-FISH) bezeichnet und wird zum quantitativen Nachweis von Mikroorganismen eingesetzt.

Bei der Synthese wird das Oligonucleotid, üblicherweise etwa 18-25 Nucleotide lang, am 5’-Ende mit einem Aminolink modifiziert. Diese reaktive Aminogruppe wird mit einem bifunktionalen Crosslinker gekoppelt und aktiviert. Die zweite reaktive Seite des Crosslinkers wird in einem weiteren Schritt mit einer freien Aminogruppe der Peroxidase zur Reaktion gebracht. Es resultiert ein Konjugat, verknüpft über chemisch stabile kovalente Bindungen. Durch geeignete Wahl der Reaktionsbedingungen und Reagenzienüberschüsse wird in etwa eine 1:1 Kopplung zwischen Oligonucleotid und Peroxidase erreicht.

Zur Reinigung und Isolierung des Konjugates hat sich die Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) als am besten geeignetes Verfahren erwiesen.

Click-FISH

Click-markierte Oligonucleotide


Der Einsatz alternativer Kopplungsstrategien eröffnet immer vielfältigere und flexiblere Möglichkeiten Modifikationen in eine Oligosequenz einzubringen.
Hervorzuheben ist hierbei die Technologie der internen Click-Modifikation von Nucleinsäuren, der sogenannten Click-FISH Methode. Die Kopplung erfolgt dabei über die heterozyklischen Pyrimidinbasen 5-Octinyl-dC, 5-Octinyl-dU oder 5-Ethinyl-dU. Die modifizierten Basen sind Cytidin und Thymidin Nucleosid-Analoga und werden während der Synthese an entsprechender Position in die wachsende Oligosequenz eingebracht.

Die eigentliche Anbindung des Markermoleküls (z.B. Fluoreszenzfarbstoffe) erfolgt indem die Azid-markierten Marker über die kupferkatalysierte Click-Reaktion mit dem Alkin der modifizierten, Click-fähigen Pyrimidine reagieren. Die Farbstoffe können vor oder auch erst nach der Hybridisierung der Sonde an das Targetmolekül binden. 

Diese Form der internen Kopplung kann auch beispielsweise für mehrfach Fluoreszenz-markierte Oligosonden, wie den tetraProbes, angewandt werden.

smiFISH

OligoPools zur in situ RNA Detektion


Eine Zwischenform der klassischen Anwendungsgebiete von FISH-Sonden stellen OligoPools dar. Hierfür werden viele kurze Oligonucleotide so designt, dass sie direkt nebeneinander auf der Ziel-DNA hybridisieren.
Vor allem bei Genexpressionsanalysen in intakten Zellen im Gewebe nimmt die in situ RNA-Detektion einen immer größeren Stellenwert ein. Oft erweist sich jedoch der Nachweis kurzer, häufig nur in wenigen Kopien vorliegende mRNA in der Zelle als sehr schwierig und aufwendig. Um die Anzahl, sowie den Wirkort einer bestimmten RNA in der Zelle besser darstellen zu können, werden daher äußerst sensitive Methoden benötigt. 
Eine Abwandlung der single molecule fluorescence in situ hybridisation (smFISH) ist die sogenannte smiFISH Methode (single molecule inexpensive fluorescence in situ hybridisation)
Ähnlich dem smFISH können auch hier einzelne RNA-Moleküle in fixierten Zellen mithilfe von nebeneinanderliegenden, kurzen Oligonucleotidsonden nachgewiesen werden. Auf diese Weise wird insgesamt ein großer Bereich der Ziel-DNA abgedeckt und trotzdem eine hohe Spezifität garantiert. 
Im Gegensatz zum smFISH benötigen die genspezifischen Primärsonden des smiFISH keinen zusätzlichen Fluoreszenzfarbstoff am 3´-Ende. 

Jede Primärsonde setzt sich aus einem genspezifischen, Target-bindenden Teil (ca. 26-32 Basen Länge) und der sogenannten FLAP-spezifischen Bindestelle (28 Basen Länge) zusammen. Alle Primärsonden tragen die identische FLAP-Sequenz, sodass eine Fluoreszenz-markierte Sekundärsonde (FLAP) daran binden kann und somit die Detektion der intrazellulären mRNA ermöglicht. Die Detektionssonde FLAP ist ein doppelt-markiertes Oligo (28 Basen Länge), das sowohl am 5´- als auch am 3´-Ende einen Fluoreszenzfarbstoff trägt. 




Durch die Bindung der komplementären Primärsonden an verschiedene Bereiche des Targets wird die nachzuweisende mRNA als kleiner fluoreszierender Punkt im Mikroskop sichtbar.
 

             


Die große Anzahl an Sonden im Set gewährleistet zudem ein hohes Maß an Sensitivität und Spezifität, sodass die Wahrscheinlichkeit falsch-positiver Ergebnisse minimiert werden kann. Erfolgt im Einzelfall eine unspezifische Bindung „off-target“, so kann lediglich eine schwache Fluoreszenz detektiert werden, die jedoch unterhalb der Detektionsgrenze spezifisch-bindender mRNA liegt.

Der Einsatz verschiedener Farbstoff-markierter FLAP-Sonden mit deutlich voneinander abgrenzbaren Emissionsspektren ermöglicht des Weiteren die Detektion mehrerer verschiedener mRNA-Moleküle in einer Zelle. Diese sogenannten Multi-colour-Imaging Assays ermöglichen auf diese Weise die gleichzeitige Detektion verschiedener mRNA, wobei auf eine Neusynthese des spezifischen Sonden-Sets verzichtet werden kann. 

Zur Detektion bestimmter RNA in einer Zelle bietet biomers.net standardmäßig drei verschiedene doppelt-markierte FLAP-Sonden an (FLAP X, FLAP Y oder FLAP Z). 
Diese können mit einer Vielzahl an möglichen Fluoreszenzfarbstoffen am 5´- und 3´-Ende markiert werden (z.B. Fam, Cyanine 3, Cyanine 5, etc.).

Name FLAP-Sondensequenz (5´-3´) Länge
     FLAP X      CAC TGA GTC CAG CTC GAA ACT TAG GAG G       28 nt
     FLAP Y      AAT GCA TGT CGA CGA GGT CCG AGT GTA A       28 nt
     FLAP Z      CTT ATA GGG CAT GGA TGC TAG AAG CTG G       28 nt
 


Das Set der hierzu passenden unmarkierten, Target-bindenden Primärsonden umfasst 24 bzw. 48 unmarkierte Oligonucleotide. Am 3´-Ende jeder Primärsonde wird die jeweils passende FLAP-spezifische Sequenz angefügt.

Name FLAP-spezifische Sequenz (angefügt an das 3´-Ende der Primärsonde) (5´-3´) Länge
    FLAP X      CCT CCT AAG TTT CGA GCT GGA CTC AGT G        28 nt
    FLAP Y      TTA CAC TCG GAC CTC GTC GAC ATG CAT T        28 nt
    FLAP Z      CCA GCT TCT AGC ATC CAT GCC CTA TAA G        28 nt
 


Unterstrichen ist jeweils ist FLAP-spezifische Sequenz; die „x“ am 5´-Ende stellen die Target-spezifische Sequenz der Primärsonden dar:

FLAP X: 5´-xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxCCTCCTAAGTTTCGAGCTGGACTCAGTG-3´
 

FLAP Y: 5´-xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxTTACACTCGGACCTCGTCGACATGCATT-3´
 

FLAP Z: 5´-xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxCCAGCTTCTAGCATCCATGCCCTATAAG-3´
 

Ein äußerst nützliches Tool zur Auswertung der umfangreichen Bildanalyse-Daten stellt die Software FISH-quant dar. Mithilfe des MATLAB-basierten freien Analyseprogramms FISH-quant kann intrazelluläre mRNA detektiert und genau lokalisiert werden.
Die Software wurde am Institut Pasteur von Dr. Florian Müller und Dr. Aubin Samacoits basierend auf Arbeiten von Hervé Marie-Nelly erstellt und erlaubt eine einfache und effiziente Quantifizierung der mRNA bei Einzelmolekül-FISH-Anwendungen (smiFISH, smFISH). 

Weitere Informationen zu FISH-quant, einem Link zum Software-Download sowie ausführliche Anleitungen und Testdaten zu smiFISH finden Sie unter https://bitbucket.org/muellerflorian/fish_quant 

In Kürze erreichen Sie an dieser Stelle auch einen Zugang zu einer ersten Testversion einer Designsoftware für smiFISH Probes

Für weitere Informationen kontaktieren Sie bitte jederzeit gerne unser Kunden Support Team.
Wir beraten Sie gerne bei der Auswahl der für Sie passenden Produkte.
Tel +49 731 70 396 0   I   info@biomers.net
 


Literatur: 

1. smiFISH and FISH-quant – a flexible single RNA detection approach with super-resolution capability. Tsanov N, Samacoits A, Chouaib R, Traboulsi A-M, Gostan T, Weber C, Zimmer C, Zibara K, Walter T, Peter M, Bertrand E, Mueller F; Nucleic Acids Research (2016), Vol. 44, No. 22 e165, doi: 10.1093/nar/gkw784.

2. FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images. Mueller F, Senecal A, Tantale K, Marie-Nelly H, Ly N, Collin O, Basyuk E, Bertrand E, Darzacq X, Zimmer C; Nat Methods. (2013), 10(4):277-8; doi: 10.1038/nmeth.2406.

PNA Probes

PNA Sonden 

 

Besonders im Hinblick auf eine verlässliche Unterscheidbarkeit eng verwandter Spezies – beispielsweise in der Erreger-Diagnostik – sind PNA-Sonden „normalen“ Oligos durch die erhöhte Bindungsspezifität bei gleicher Länge deutlich überlegen. PNA sind durch das Peptid-Rückgrat, das sie von natürlichen Nucleinsäuren unterscheidet, extrem resistent gegenüber Nucleaseverdau und weisen zudem eine höhere Bindungsaffinität auf, sodass auch sehr kurze PNA-Oligonucleotide eine gute Spezifität garantieren. PNA-Sonden sind für Routine-Untersuchungen über lange Zeiträume deshalb gut geeignet. 

Links

Links für Probe Design 

 

Für das Design und die Anwendung von Probes im Bereich der in-situ Hybridisierung empfehlen wir Ihnen die folgenden Links:
 

Arb-Silva (www.arb-silva.de)
Die SILVA rRNA Datenbank ist ein Projekt des Max-Planck-Instituts für Marine Mikrobiologie in Bremen. Die SILVA Datenbank ist die weltweit größte und aktuellste Sammlung ribosomaler RNA-Sequenzen aller Lebensformen (Bakterien, Archaeen und Eukaryoten) und damit für taxonomische und phylogenetische Fragestellungen eine der ersten Adressen. Neben speziell entwickelter Software für das Aligning, Handling und die Auswertung der Sequenzdaten bietet die Webseite eine umfassende Arbeits- und Troubleshooting-Sammlung für Fluoreszenz in situ-Hybridisierungen.

Ribocon (www.ribocon.com)
Ribocon bietet Industrie und Akademien aus dem Bereich der Umwelt-, klinischen und molekularen Mikrobiologie bioinformatische Dienstleistungen und Lösungsvorschläge an. Insbesondere bei mikrobiellen Diversitätsanalysen, phylogenetischen Untersuchungen und beim Design kundenspezifischer Probes verfügt das Ribocon Team über exzellente und jahrelange Erfahrungen.

probeBase (www.microbial-ecology.net/probebase
Der Onlineserver probeBase wird von der Abteilung der mikrobiellen Ökologie der Universität Wien zur Verfügung gestellt. Er ermöglicht die gezielte Suche von FISH-und Microarray-Sonden und PCR-Primern nach Name, Sequenz oder Zielorganismus. Darüber hinaus ist eine ausführliche Dokumentation der gelisteten Probes verfügbar.

Protocols (www.environmental-microbiology.de/lab_issues.html)
Eine Sammlung informativer Laborprotokolle und hilfreicher Links stellt Ihnen die Abteilung der Mikrobiologie der Technischen Universität München zur Verfügung. 


 


Literatur: 

1. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: quantitative imaging of single RNA molecules. Kwon S; BMB Rep. (2013),46(2):65-72.

2. Fluorescence In situ Hybridization: Cell-Based Genetic Diagnostic and Research Applications. Cui C, Shu W, Li P; Front Cell Dev Biol. (2016); 4: 89.

3. Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medical significance. Bishop R; Bioscience Horizons (2010), Volume 3, Issue 1, Pages 85–95.