Real-Time PCR Probes
 

Bei dem sogenannten TaqMan®-Assay wird eine Sonde so auf der Ziel-DNA plaziert, das diese "im Weg" der Polymerase sitzt.
Im hybridisierten Zustand der Sonde reicht die räumliche Nähe von Fluorophor und Quencher, um die Fluoreszenz  zu quenchen (abzuschalten). Während der PCR wird nun die 3´-5´-Exonuklease-Aktivität der Taq-Polymerase genutzt, um die Sonde abzubauen. Dadurch werden Fluorophore und Quencher voneinander getrennt und die Fluoreszenz freigesetzt.

Gerne stehen wir Ihnen bei Fragen zum Design dieser Sonden und den zugehörigen Primern zur Seite.

* Im Preis inbegriffen ist jeweils ein Oligonucleotid bis max. 30 Basen inklusive HPLC-Reinigung und der Maldi-Qualitätskontrolle mit den oben genannten Fluorophor/Quencher-Kombinationen. Der Preis ist nur gültig für elektronische Bestellung über das biomers.net Online-Bestellformular zzgl. ges. MwSt. und ggf. Versandkosten. Weitere Konditionen ergeben sich aus der jeweils gültigen Preisliste. Preisänderungen und Irrtum vorbehalten. 

* Im Preis inbegriffen ist jeweils ein Oligonucleotid bis max. 30 Basen im Scale S (garantierte Liefermenge >1OD) inklusive HPLC-Reinigung und der Maldi-Qualitätskontrolle mit den oben genannten Fluorophor/Quencher-Kombinationen. Der Preis ist nur gültig für elektronische Bestellung über das biomers.net Online-Bestellformular zzgl. ges. MwSt. und ggf. Versandkosten. Weitere Konditionen ergeben sich aus der jeweils gültigen Preisliste. Preisänderungen und Irrtum vorbehalten.

Die üblichen qPCR Sonden für 5'-Nuclease Assays tragen am 5'-Ende einen Fluorophor und am 3'-Ende einen passenden Quencher, welcher zum einen die Fluoreszenz des Farbstoffes löscht und zum anderen die Verlängerung der Sonde während der qPCR-Reaktion verhindert. Bei längeren Sonden und damit größerem Abstand zwischen Fluorophor und Quencher nimmt der Background oft in ungewünschtem Maße zu.

Mit Double Quenched Probes verringert sich der Background und erhöht sich die Sensitivität. Durch Einbau eines zusätzlichen Quenchers (z.B. BMN-Q535 oder BMN-Q620) in die Sequenz nahe des 5'-Fluorophors kann eine deutliche Verbesserung der Resultate erzielt werden.

Double Quenched Probes enthalten einen 5'-Fluorophor, einen 3'-BMN-Quencher sowie einen internen BMN-Quencher in einem Abstand von 8-10 Basen vom Fluorophor. 

Dual-Labelled Probe	Double Quenched Probe
5'-Fam, Hex, Cyanine, Atto-Dyes, uvm.      3'-BMN-Q535, BMN-Q620	5'-Fam, Hex, Rox, Cyanine, Atto-Dyes, uvm.      int. BMN-Q535, BMN-Q620      3'-BMN-Q535, BMN-Q620

Standard Dual-Labelled Probes und Double Quenched Probes mit BMN-Quenchern können über das biomers.net Web-Bestellformular online bestellt werden. 
Eine ausführliche Bestellanleitung für Double Quenched Probes finden Sie hier.  

Für weitere Informationen und Unterstützung bei der Bestellung kontaktieren Sie bitte gerne unseren Kundenservice.

MGB-modifizierte Oligonucleotide besitzen eine erhöhte Schmelztemperatur (Tm) und Spezifität und können äußerst stabile Duplexe mit komplementären DNA-Sequenzen bilden. Hierbei wird die Schmelztemperatur T_m der modifizierten Oligos stark von der Basenzusammensetzung beeinflusst.
Bei der Bindung der Sonde an die Zielsequenz binden Minor Groove Binder (MGB) an die kleine Furche der DNA. Die sichelförmige Gestalt der MGB CDPI3 (Dihydropyrroloindolecarboxylate Tripeptide CDPI₃) erlaubt eine exakte räumliche Anpassung an die gekrümmte Struktur der kleinen Furche und ermöglicht damit eine Einlagerung zwischen die Zucker-Phosphat-Ketten des DNA-Rückgrats. Diese isohelikale Konformation wird dabei vor allem mittels wirkender Van-der-Waals Kräfte und hydrophober Wechselwirkungen stabilisiert.
Auf diese Weise kann eine hohe Stabilität des doppelsträngigen Moleküls erzielt werden, sodass auch sehr kurze DNA-Sonden äußerst effizient an die Target-DNA hybridisieren können. 

Abbildung 1 zeigt die Schmelzkurvenanalyse eines MGB CDPI₃-modifizierten und eines unmodifizierten Oligos. Der Analyse wurde in Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7.4 durchgeführt. Die Natrium-Konzentration betrug 30 mM; die eingesetzte Konzentration der DNA-Einzelstränge lag bei ca. 1,3 µM. Der Wendepunkt der Schmelzkurve gibt jeweils die Schmelztemperatur T_m des Oligos an. 
Die blaue Kurve stellt ein unmodifiziertes EUB338-Oligo dar: 5´-gctgcctcccgtaggagt-3´. Der Schmelzpunkt liegt hier bei ca. 55°C. 
Die grüne Kurve zeigt die Schmelzkurve eines MGB CDPI3-modifizierten Oligos. Das EUB-Oligo wurde am 3´-Ende mit einer MGB CDPI3-Modifikation markiert: 5´-gctgcctcccgtaggagt-MGB CDPI3. Der hier ermittelte Schmelzpunkt liegt bei ca. 65°C. 
Im direkten Vergleich der beiden Oligonucleotide kann unter den hier gewählten Bedingungen ein Anstieg der Schmelztemperatur um ca. 10°C festgestellt werden. 

Eine ausführliche Bestellanleitung für MGB Probes finden Sie hier.  
Für weitere Informationen und Unterstützung bei der Bestellung kontaktieren Sie bitte gerne unseren Kundenservice.

Literatur:

1. 3′-Minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures. Kutyavin IV, Afonina IA, Mills A, Gorn VV, Lukhtanov EA, Belousov ES, Singer MJ, Walburger DK, Lokhov SG, Gall AA, Dempcy R, Reed MW, Meyer RB, Hedgpeth J; Nucleic Acids Research (2000), Volume 28, Issue 2, Pages 655–661.

2. Minor Groove Binder-Conjugated DNA Probes for Quantitative DNA Detection by Hybridization-Triggered Fluorescence. Afonina IA, ReedMW, Lusby E, Shishkina IG, Belousov YS; BioTechniques (2002) 32:940-949 .

Eine weitere Variante stellen die Molecular Beacons® dar. Wie bei den daraus abgeleiteten Scorpions®-Oligos, weisen Molecular Beacons eine ´stem´ -Region (stem=Stamm) auf. Diese setzt sich aus einer kurzen Region zueinander komplementärer Nucleinsäuren zusammen, sodass sich das Molekül mit sich selbst falten kann. Die spezifische Sondensequenz, die komplementär zur Targetsequenz ist, bildet in dieser Konformation die sogenannte Loop-Region. 

In Abwesenheit eines passenden Targets werden die jeweils terminal gekoppelten Modifikationen (Farbstoff und Quencher) durch den ´stem´ in enger räumlicher Nähe gehalten, sodass die Fluoreszenz inhibiert wird. In diesem Zustand überträgt der Fluorophor seine Elektronen auf den Quencher, der diese Energie wiederum in Form von längerwelligen Licht oder Wärme abgibt.

In Anwesenheit eines passenden Targetmoleküls öffnet sich der Beacon durch Bindung der ´loop´-Region an die entsprechende Zielsequenz. Dieses Sonden-Target-Hybridmolekül ist länger und so konzipiert, dass die Bindung an die Targetregion thermodynamisch begünstigt ist und deshalb letztendlich zur Öffnung des Molecular Beacons führt. Die Änderung der Konformation trennt hierbei Fluorophor und Quencher, sodass die Fluoreszenz freigesetzt werden kann. 

Molecular Beacons sind äußerst spezifisch und sind im Idealfall in der Lage Unterschiede zu identifizieren, die lediglich auf einem einzelnen Nucleotid beruhen. Die Länge der Sondensequenz wird dafür so gewählt, dass sie ein perfekt komplementäres Sonden-Target-Hybridmolekül bilden können, das gerade stabiler ist als die komplementäre ´stem´-Region. Bereits ein abweichendes Nucleotid in der Sondensequenz verringert dann die Stabilität des Sonden-Target-Moleküls ausreichend, sodass die Stabilität der ´stem´-Region überwiegt und die Öffnung des Molecular Beacon verhindert wird. 

Aufgrund ihres besonderen Verhaltens sind Molecular Beacons vielseitig einsetzbar:

• PCR
• Detektion bestimmter RNAs in lebenden Zellen1
• Amplicon-Detektion in der Diagnostik
• Multiplex Assays zur Detektion verschiedener Targets in einem Reaktionsansatz
• SNP Detektion 
• Pharmakogenetische Anwendungen 
• Genetisches Screening (Genotypbestimmung eines Locus)

Unter www.molecular-beacons.org erhalten Sie umfassende Informationen über Molecular Beacons und ihre Einsatzgebiete.

Wir freuen uns, Ihnen den Service unseres Probe Designs für Molecular Beacons®, Scorpions® und TaqMan® Probes anbieten zu können. 
Schicken Sie uns hierzu einfach die Basensequenz Ihres Targets, das Sie testen möchten. Unsere erfahrenen Spezialisten designen Ihre individuelle Probe. 

Wenn Sie weitere Informationen zu diesem Thema wünschen, kontaktieren Sie uns bitte jederzeit. 
Tel +49 731 70 396 0   ǀ   info@biomers.net

Eine verwandte Anwendung findet sich im LightCycler®-Assay. Dazu werden zwei Sonden hintereinander auf der Ziel-DNA plaziert. Durch die Bindung beider Sonden wird eine extrem hohe Spezifität der Real-time PCR erreicht, die zum Beispiel eng verwandte Gene oder Organismen differenzieren kann. 

Die 5´-gelegene Sonde trägt an ihrem 3´-Ende eine Fluorophore, deren Fluoreszenz nicht direkt gemessen, sondern zur Anregung der Fluorophore der zweiten Sonde genutzt wird. Durch diese Übertragung (FRET: fluorecsence resonance energy transfer) wird bei erfolgreicher Bindung beider Sonden die Fluoreszenz der 3´-gelegenen Sonde detektiert.